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免疫治療無疑是當(dāng)下最熱門最前沿的癌癥治療方法，而納米顆粒介導(dǎo)的納米疫苗是其中一個越來越重要的研究領(lǐng)域。產(chǎn)生腫瘤特異性的T細(xì)胞是納米疫苗發(fā)揮作用的關(guān)鍵所在，這個過程涉及對抗原輸送到淋巴結(jié)的時空控制、抗原在抗原呈遞細(xì)胞（APC）中的胞質(zhì)輸送及其交叉呈遞。目前研究表明小于50 nm的納米顆粒更容易富集在淋巴結(jié)，但是迄今為止很少有50 nm以下的納米顆?？梢栽跓o佐劑的情況下促進(jìn)抗原呈遞并刺激固有免疫反應(yīng)，這也是目前的納米疫苗組分復(fù)雜的最主要原因。

近日，來自美國德克薩斯大學(xué)西南醫(yī)學(xué)中心的高金明（Jinming Gao）教授和美國國家科學(xué)院院士陳志堅（Zhijian J. Chen）教授等人發(fā)現(xiàn)，一種由酸度響應(yīng)聚合物組成的納米顆粒（PC7A）與抗原組成的簡單復(fù)合物不僅可以有效促進(jìn)抗原在抗原遞呈細(xì)胞中的胞質(zhì)輸送、顯著增強(qiáng)抗原呈遞，還可以通過激活Ⅰ型干擾素刺激因子（STING）刺激產(chǎn)生Ⅰ型干擾素，從而顯著增強(qiáng)該納米疫苗的抗癌效應(yīng)。相關(guān)工作發(fā)表于Nature Nanotechnology上，共同第一作者為Min Luo博士、Hua Wang博士和Zhaohui Wang博士。

高金明教授課題組早期致力于腫瘤早期診斷磁共振納米探針的開發(fā)，近幾年則致力于腫瘤微環(huán)境響應(yīng)性診斷探針的開發(fā)與轉(zhuǎn)化。該課題組此前曾開發(fā)出了一系列基于聚乙二醇-聚甲基丙烯酸酯、對生理環(huán)境pH（4-7.4）高度敏感的pH超敏納米顆粒，已經(jīng)成功用于腫瘤微環(huán)境診斷（Nat. Mater., 2014, 13, 204-212）及手術(shù)指導(dǎo)?？紤]到該類納米顆粒尺寸僅為20-50 nm，同時可以在特定pH條件下發(fā)揮質(zhì)子海綿效應(yīng)，破壞細(xì)胞膜，促進(jìn)物質(zhì)的胞質(zhì)運輸，他們推測這些納米顆粒可能具有促進(jìn)抗原胞質(zhì)輸送及運輸至淋巴結(jié)的能力。因此他們先在小鼠體內(nèi)評估了這些納米顆粒產(chǎn)生細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞（CTL）反應(yīng)的能力。

他們使用卵清蛋白（OVA）為模式抗原，將之與納米顆粒復(fù)合形成納米疫苗并皮下注射到小鼠體內(nèi)，然后通過體內(nèi)CTL試驗檢測OVA特異性的CTL反應(yīng)，發(fā)現(xiàn)納米疫苗OVA-PC7A介導(dǎo)的OVA特異性脾臟細(xì)胞殺傷率最高（達(dá)82%），其殺傷效率是相同pH值響應(yīng)的OVA-PC6S1A和OVA-PEPA的兩倍，而線性氨聚合物中，OVA-PEPA產(chǎn)生的CTL反應(yīng)最強(qiáng)，這表明聚合物結(jié)構(gòu)和響應(yīng)性pH值都對納米疫苗產(chǎn)生的CTL強(qiáng)度有影響。同時，OVA-PC7A產(chǎn)生的CTL反應(yīng)強(qiáng)度是OVA-alum或者OVA-LPS（均激活toll樣受體4（TLR4）通路）的20倍，是OVA-CpG（激活TLR9通路）的3.6倍。此外它還可以產(chǎn)生OVA特異性的IgG1和IgG2c抗體，這意味著基于PC7A的納米疫苗可以誘導(dǎo)產(chǎn)生強(qiáng)烈的抗原特異性CTL反應(yīng)、Th1和Th2反應(yīng)，效果甚至優(yōu)于現(xiàn)有的成熟佐劑-抗原組合。

為了示蹤納米顆粒在體內(nèi)的運動，作者采用吲哚菁綠標(biāo)記了PC7A納米顆粒，在小鼠尾基部注射后采用活體成像研究了納米顆粒的體內(nèi)分布。他們發(fā)現(xiàn)納米顆粒在注射后24小時可以到達(dá)外周淋巴結(jié)，而基本不分布到其他器官。通過使用熒光分子標(biāo)記的OVA并采用流式細(xì)胞術(shù)分析淋巴結(jié)中OVA陽性的巨噬細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞（DC），作者發(fā)現(xiàn)PC7A介導(dǎo)的OVA在所有細(xì)胞中的分布均多于游離的OVA。與游離OVA相比，OVA-PC7A使OVA陽性的CD8α+DC的數(shù)量增加了29倍，而該細(xì)胞對誘導(dǎo)CTL反應(yīng)至關(guān)重要。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)盡管骨髓來源樹突狀細(xì)胞（BMDC）對OVA-PC7A和OVA-PD5A的攝取能力相當(dāng)（均高于游離的OVA），但是PC7A誘導(dǎo)的抗原呈遞數(shù)量比其他兩組高3倍，PC7A處理后的BMDC可以促使OT-I小鼠來源的CD8+T細(xì)胞產(chǎn)生IFN-γ的量明顯增加，OVA-PC7A在體內(nèi)刺激產(chǎn)生OVA特異性的CD8+T細(xì)胞的數(shù)量也比其他兩組高15倍。這些結(jié)果表明PC7A可以顯著增強(qiáng)抗原在APC中的胞質(zhì)輸送和抗原呈遞，從而顯著增強(qiáng)產(chǎn)生的抗原特異性T細(xì)胞的量。

由于共刺激信號（CD80/86）和細(xì)胞因子也是誘導(dǎo)強(qiáng)烈腫瘤特異性CTL反應(yīng)的必要因素，因此作者檢測了納米疫苗對APC共刺激分子表達(dá)和細(xì)胞因子分泌的影響。采用納米疫苗免疫后24小時，取小鼠的腹股溝淋巴結(jié)進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)OVA-PC7A刺激后各種APC表面CD86的表達(dá)量均高于對照組，同時IFN刺激基因（包括IRF7和CXCL10）的表達(dá)量也有所增加。和Poly(I:C)（陽性對照）及OVA-PD5A相比，OVA-PC7A在免疫后24小時誘導(dǎo)產(chǎn)生的免疫反應(yīng)更強(qiáng)。通過在一系列基因缺陷小鼠體內(nèi)進(jìn)行相同實驗，作者發(fā)現(xiàn)OVA-PC7A誘導(dǎo)的免疫反應(yīng)并非依賴于TLR及線粒體抗病毒信號蛋白通路（MAVS），而是依賴于STING通路（注：TLR、MAVS和STING通路是APC中介導(dǎo)抗癌免疫反應(yīng)的三個重要細(xì)胞信號通路），可能原因是PC7A直接和STING相互作用而激活STING。在這個過程中，APC（尤其是DC）是吞噬OVA-PC7A的主要細(xì)胞亞群，隨后細(xì)胞內(nèi)的STING-I型IFN信號通路被激活，從而增強(qiáng)了該納米疫苗抗癌免疫反應(yīng)。盡管作者認(rèn)為還需要進(jìn)一步實驗確認(rèn)PC7A激活STING的機(jī)制，但是并未在本文進(jìn)行深入研究。

基于以上實驗結(jié)果，作者采用幾種腫瘤模型驗證了該疫苗的抗癌療效。在B16-OVA黑素瘤模型中，OVA-PC7A疫苗療效最佳，植瘤40天后還有50%的小鼠存活，而單獨的抗原組或者OVA-PD5A組的小鼠在20天左右就全部死亡。在B16-F10黑素瘤和直腸癌MC38模型中，抗原-PC7A疫苗組療效均優(yōu)于其他對照組。而在人乳頭狀瘤病毒（HPV）E6/7 TC-1腫瘤模型中，抗原-PC7A疫苗可以使50%的小鼠在植瘤后60天的時間里保持無腫瘤狀態(tài)。而將抗原-PC7A與抗PD-1抗體聯(lián)合使用時，植TC-1腫瘤的小鼠在60天后全部存活，有90%的小鼠無腫瘤。同時，組織學(xué)分析發(fā)現(xiàn)PC7A納米疫苗治療的小鼠各器官未觀察到明顯的毒性?？傮w而言，該納米疫苗可以在抗原用量較低（0.5 μg）的條件下產(chǎn)生較強(qiáng)烈而安全的抗腫瘤免疫反應(yīng)，同時與免疫檢驗點抑制劑具有協(xié)同抗癌效應(yīng)。

——總結(jié)——

本文介紹了一種具有佐劑效應(yīng)的新型疫苗，尺寸效應(yīng)促進(jìn)其淋巴結(jié)富集，而pH響應(yīng)性促進(jìn)抗原的胞質(zhì)輸送及交叉呈遞。同時，研究人員發(fā)現(xiàn)PC7A具有結(jié)合STING的效應(yīng)，因而該納米疫苗具有較強(qiáng)的抗癌效應(yīng)。

咋一看，能發(fā)現(xiàn)這樣一個現(xiàn)象實屬運氣，但是事實上能夠把這項研究做到發(fā)Nature Nanotechnology 的水平確實不能全靠運氣。高金明教授實驗室擁有一系列性質(zhì)優(yōu)良的聚合物，促使他們有機(jī)會發(fā)現(xiàn)PC7A具有促內(nèi)涵體逃逸、促抗原呈遞效應(yīng)以及STING激活效應(yīng)，這說明研究積累很重要；其次，高金明教授與陳志堅教授同在一個單位，恰巧后者是cGAP-STING信號通路研究大咖，每年均有2、3篇CNS文章到手，本文關(guān)于PC7A激活STING的機(jī)理研究算是手到擒來，這說明優(yōu)秀的合作伙伴也非常重要。這一工作可謂是“天時地利人和”的結(jié)果。（不多說了，回去合成聚合物去了。另外，優(yōu)秀的合作伙伴們，快到碗里來吧！在下這里有很多聚合物~~）