H5亞型禽流感（如H5N1）是一種全世界范圍的人畜共患病，嚴重威脅著家禽產(chǎn)業(yè)以及人類的健康。對禽流感病毒進行及時、定量和亞型檢測，是疾病快速診斷和疫情防控的重要基礎。中國科學院微生物研究所杜文斌（點擊查看介紹）課題組與中國科學院動物研究所何宏軒（點擊查看介紹）課題組最近合作開發(fā)了一種數(shù)字化恒溫擴增的方法，實現(xiàn)了對禽流感病毒H5亞型的快速定量檢測。
該研究采用了杜文斌課題組先前報道的界面打印液滴生成方法（Cross-interface Emulsification, XiE）（Anal. Chem.,2016, 88, 3171-3177）。其原理是利用穩(wěn)定流速注射液體的毛細管在油-氣界面處固定頻率振動，利用在油-氣界面表面張力的周期性切割作用，實現(xiàn)均一液滴的制備。通過該方法，可快速連續(xù)生成大量皮升至納升體積微液滴，平鋪于96孔板容器底部形成液滴陣列，適合于實現(xiàn)數(shù)字化核酸擴增分析。XiE技術(shù)不依賴于微加工技術(shù)，成本低、操作自動化程度高，對于常規(guī)實驗室及非專業(yè)人士尤為適用。
該研究采用環(huán)介導等溫擴增技術(shù)（Loop-mediated isothermal amplification，LAMP），使核酸擴增可以在恒溫條件（60-65 °C）下進行，是對傳統(tǒng)PCR技術(shù)的重要改進，尤其適用于條件欠發(fā)達地區(qū)以及現(xiàn)場快速檢測。數(shù)字等溫擴增技術(shù)，通過XiE系統(tǒng)將反應體系分隔在大量大小均一的液滴中，每一個微液滴即為一個反應單元，基于泊松分布原理，進行獨立的單拷貝核酸分子等溫擴增，達到對起始模板數(shù)量進行精確統(tǒng)計的目的，在準確性、靈敏度和絕對定量（不依賴于標準曲線）方面有了革命性的改進，尤其適用于病毒載量的定量檢測。因而，開發(fā)適用于禽流感檢測的數(shù)字LAMP技術(shù)具有重要意義。
本研究針對H5亞型的禽流感病毒的快速定量，開展了模型驗證和禽流感真實樣品的檢測。建立了特異性的H5亞型禽流感病毒LAMP檢測引物探針，首次驗證了數(shù)字LAMP用于H5禽流感病毒檢測的特異性、靈敏度和線性范圍。研究結(jié)果表明，數(shù)字LAMP與實時熒光定量PCR以及美國伯樂公司的QX200數(shù)字PCR系統(tǒng)的檢測靈敏度和線性一致，具有良好的特異性和準確性。值得指出的是，相比于數(shù)字PCR和熒光定量PCR，數(shù)字LAMP表現(xiàn)出更好的抗抑制劑能力（如腐植酸、SDS等），可以保證該方法對沒有充分除去污染物的野外或臨床樣品檢測的可靠性。
該課題得到國家重點研發(fā)計劃的支持(2016YFC0100900)，相關(guān)研究成果在線發(fā)表在Analytical Chemistry 上。中科院動物研究所何宏軒研究員的博士后胡奕和杜文斌課題組的徐鵬為該文章的共同第一作者。
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